Forschung

In allen eukaryontischen Zellen spielt das endoplasmatische Retikulum (ER) eine zentrale Rolle bei der Proteinbiosynthese. Im ER-Lumen findet die Faltung neu synthetisierter sekretorischer und Membranproteine statt. Richtig gefaltete und zusammengesetzte Proteine verlassen das Organell und setzen ihre Reise auf dem sekretorischen Weg fort. Die Proteinfaltung ist jedoch fehleranfällig und die Anhäufung von falsch gefalteten oder überschüssigen Proteinen gefährdet das zelluläre Gleichgewicht und damit das Überleben von Organismen. Dieses zelluläre Gleichgewicht ist besonders gefährdet unter widrigen Umweltbedingungen. Folglich haben Zellen ausgeklügelte Qualitätskontrollprozesse etabliert, die den Export von biologisch aktiven Proteinen und die Eliminierung nicht-nativer Proteine sicherstellen. An diesen Qualitätskontrollprozessen sind Proteine beteiligt, die faltungsdefekte Proteine erkennen und durch einen genau kontrollierten Proteinabbauprozess, der als ER-assoziierter Abbau (ERAD) bekannt ist, gezielt zerstören. Der Abbau von faltungsdefekten Glykoproteinen wird im Lumen des ER eingeleitet. Die spezifischen Proteine, welche die fehlgefalteten Glykoproteine erkennen und ihr Schicksal bestimmen, sind jedoch noch unbekannt. Wir vermuten, dass Proteinkomplexe, bestehend aus Alpha-Mannosidasen und Thioredoxinen, Schlüsselfaktoren in diesem Prozess sind. Die Rolle dieser Komplexe soll mit genetischen, biochemischen und zellbiologischen Ansätzen untersucht werden. Das Projekt wird dazu beitragen, Mechanismen der Proteinqualitätskontrolle in Pflanzen besser zu verstehen, was langfristig zu neuen Strategien zur Verbesserung der Pflanzenfitness unter sich ständig ändernden Umweltbedingungen führen wird.

Weiterer Forschungskontext Der Rezeptor für den programmierten Zelltod 1 (PD-1) und sein Ligand, der programmierte Zelltod-Ligand 1 (PD-L1), sind Immun-Checkpoint-Proteine, die das Immunsystem regulieren. Unter physiologischen Bedingungen führt ihr Zusammenspiel zu einer Unterdrückung des T-Zell-Immunsystems. Krebszellen können diesen Weg jedoch umgehen, indem sie PD-L1 exprimieren, um der Immunerkennung zu entgehen. Immuntherapien, die auf die PD-1/PD-L1-Achse abzielen, stellen einen wichtigen Durchbruch in der Krebsbehandlung dar. Mehrere PD-1- und PD-L1-Antikörper sind bereits von der FDA zugelassen. Ihre Wirksamkeit ist jedoch unbeständig und kaum vorhersehbar, weshalb die Entwicklung von PD-1/PD-L1-Inhibitoren, die keine Antikörper sind, vorangetrieben wird. PD-1 und PD-L1 sind stark glykosylierte Proteine, doch die Rolle spezifischer Glykane bei ihrer Interaktion ist nur unzureichend bekannt. Studien über die Auswirkungen der Glykosylierung haben sich auf experimentelle Studien mit Glyko-(Null)-Mutanten konzentriert. Außerdem gibt es keine Berichte über die Auswirkungen der Glykosylierung auf Antikörper, deren Wirkungsweise eine Rezeptorblockade ist und keine ADCC- oder CDC-Aktivität erfordern sollte. Es besteht eindeutig eine Wissenslücke zwischen unserem derzeitigen Verständnis der Immunregulation und der Frage, wie diese manipuliert werden kann, um die klinische Wirksamkeit von Immun-Checkpoint-Blockade-Therapien bei Krebs zu verbessern. Zielsetzung und Methoden Das vorgeschlagene Projekt zielt darauf ab, das System der transienten Expression in N. benthamiana und seine Eignung für das Glyco-Engineering zu nutzen, um Immun-Checkpoint-Proteine und Antikörper mit definierten und homogenen humanähnlichen Glykanen herzustellen. Diese werden verwendet, um den funktionellen Einfluss von Glykanen auf die PD-1/PD-L1-Interaktion zu bestimmen. Darüber hinaus werden die durch Glyco-Engineering hergestellten pflanzlichen Proteine in vitro auf ihre Bindungsaffinität und Effektor-Funktionen untersucht. Wir erwarten, dass wir glykanoptimierte Proteine identifizieren können, die als Lockvogel-/Fangmoleküle fungieren können, um die Bindung von PD-L1 in Tumorzellen an PD-1 in T-Zellen zu hemmen. Grad der Originalität Eine eingehende Analyse der Rolle der Glykosylierung bei PD-L1/PD-1-Wechselwirkungen liegt noch nicht vor. Studien über die funktionelle Aktivität von glykooptimierten Proteinen werden wahrscheinlich wichtige Erkenntnisse über glykanabhängige Wechselwirkungen liefern, die bei therapeutischen Anwendungen in der Krebsbehandlung helfen werden. Diese Forschung stellt einen vielversprechenden neuen und schnellen Weg zur Herstellung und Validierung therapeutischer rekombinanter Proteine dar, der die Zeit bis zum Erreichen bedeutender klinischer und experimenteller Fortschritte in der Krebsimmuntherapie verkürzen kann. Die wichtigsten beteiligten Forscher Alexandra Castilho, die über 27 Jahre Erfahrung in der Molekulargenetik und Zellbiologie und 18 Jahre auf dem Gebiet der pflanzlichen N-Glykosylierung verfügt, wird für die Durchführung des Projekts in enger Zusammenarbeit mit Experten auf den Gebieten Glykoproteomik (Johannes Stadlmann), pflanzliches Molecular Farming (Lukas Mach und Waranyoo Phoolcharoen), Immunologie (Peter Steinberger) und Glykosylierung in der Krebstherapie (Celso Reis) verantwortlich sein.

The plant-specific family of arabinogalactan proteins (AGPs) is implicated with a multitude of biological functions and their O-glycan might be crucial for either ligand interactions or for crude biophysical or structural protein properties. In this research proposal, however, I propose a role of O-glycosylation of the AGP type for protein fate by introducing the concept of an O-glycosylation checkpoint. I discuss evidence for the importance of O-glycosylation for protein fate in all eukaryotes and specifically describe the case of the moderately O-glycosylated FASCICLIN-LIKE ARABINOGALACTAN PROTEIN 4 (FLA4) from Arabidopsis thaliana. FLA4 abundance and localization strongly depends on its O-glycosylation. With a set of hydroxyproline-specific galactosyl transferases FLA4 acts in a linear genetic pathway necessary for normal root growth, salt tolerance and seed coat structure. Using FLA4 as genetic paradigm for a functional O-glycoprotein, I suggest hypothetical models of where and how O-glycosylation might influence the fate of plant proteins. I propose experimental approaches to elucidate the genetic and molecular mechanisms that determine the fate of FLA4 in dependence of its O-glycosylation status. Precise definition of proline hydroxylation and -glycosylation as well as molecular identification of crucial modification sites on FLA4, the cell biological elucidation of the involved organelles and the investigation of the degradation mechanism will comprise the first example for an endogenous plant protein that is controlled by its O-glycosylation state. Forward genetic isolation and next generation sequencing-based identification of suppressors of O-glycan dependent control of FLA4 abundance will provide novel genetic components of this process. A remarkable set of signalling proteins that have not previously been considered to be O-glycosylated, potentially also contain this modification. Therefore, it is likely that the O-glycan checkpoint acts on various regulatory pathways. The outcomes of this project will provide an important contribution to our fundamental knowledge of protein glycosylation and proteostasis and might thus contribute to improved stress tolerance of crop plants and the use of plants as factories