Forschung

Breiterer Forschungskontext: Von den fünf menschlichen Hämperoxidasen, deren Entwicklung sehr unterschiedliche Funktionen erfüllt, ist die Schilddrüsenperoxidase (TPO) die am wenigsten gut untersuchte. Das Multidomänen-Membranprotein katalysiert die Biosynthese von Schilddrüsenhormonen, die für Stoffwechsel, Wachstum und Entwicklung des menschlichen Körpers unerlässlich sind. Durch den Einsatz von Wasserstoffperoxid katalysiert TPO die Jodierung und Kopplung von Tyrosinresten auf der Oberfläche von Thyreoglobulin (TG) in der Schilddrüse. Allerdings gibt es offene Fragen zur Substratselektivität, den biochemischen Eigenschaften, dem Kopplungsmechanismus und den Rollen der einzelnen Domänen. Entscheidend ist, dass TPO der Kern zweier autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen ist, an denen zusammen fast 150 Millionen Menschen leiden. Die einzigen beiden klinisch zugelassenen TPO-Hemmer sind jedoch nicht spezifisch. Ziele: Dieses Projekt wird die biochemischen und strukturellen Eigenschaften von TPO aufklären. Die Hauptziele sind (I) das Verständnis der Kinetik und Substratspezifität von TPO, (II) die Bereitstellung von Strukturdaten von TPO allein und relevanten Ligationszuständen und (III) die Klärung der Wirkungsweise von TPO-Inhibitoren. Ansatz: In Vorarbeiten wurde ein Expressions- und Reinigungsprotokoll für verkürzte TPO-Varianten erstellt. Wichtig ist, dass festgestellt wurde, dass es möglich ist, den Häm-Cofaktor auch nach der Reinigung wiederherzustellen und zu verknüpfen, wodurch hochreines und enzymatisch aktives rekombinantes TPO entsteht. Dies ermöglicht die erste detaillierte spektroskopische, thermodynamische und strukturelle Untersuchung des Enzyms. Dazu gehört eine Analyse der Reaktionskinetik von TPO mit einer Reihe von Methoden, einschließlich Stopped-Flow-UV-Vis-Spektroskopie für prästationäre Kinetiken, Analyse der Wechselwirkung mit kleinen Molekülen (z. B. Inhibitoren, Liganden) und TG mit Thermodynamik und Masse spektroskopische Untersuchungen. Schließlich zielt dieses Projekt darauf ab, die Röntgenkristallstruktur von TPO allein und im Komplex mit biologisch relevanten Substraten, Liganden und Inhibitoren aufzuklären. Maß an Originalität: TPO ist entscheidend für die Biosynthese von Schilddrüsenhormonen. Bisher sind jedoch nur wenige biochemische und strukturelle Daten verfügbar, die (I) keine klare Erklärung der Struktur-Funktions-Beziehung der Architektur des aktiven Zentrums und der TPO-Reaktivität, (II) der Rolle der zusätzlichen TPO-Domänen und (III) ermöglichen ) das Design neuer, spezifischerer Inhibitoren. Ziel dieses Projekts ist es, eine vollständige enzymatische und strukturelle Charakterisierung von TPO bereitzustellen, um diese Probleme anzugehen. Beteiligte Primärforscher: Vera Pfanzagl schloss 2019 das internationale PhD-Programm BioToP an der BOKU ab. Sie arbeitete hauptsächlich an Struktur-Funktions-Beziehungen von Häm-Enzymen und konzentrierte sich während ihres Postdocs auf menschliche Häm-Peroxidasen. Im Rahmen dieses Stipendiums strebt sie die Habilitation an, um ihre akademische Karriere voranzutreiben. Unterstützt und gecoacht wird sie von Kristina Djinovic-Carugo, einer anerkannten Expertin für Strukturbiologie und Leiterin des EMBLE Grenoble, und Chris Oostenbrink (Professor an der BOKU), einem Experten für molekulare Modellierung und Simulation.

CAR T cell therapy is a breakthrough in cellular therapy for the treatment of cancer. For this therapy, the patient´s T cells are equipped with a chimeric antigen receptor (CAR) that has an exrtacellular binding domain to bind to target antigens on the surface of tumor cells and subsequently lyse them. These binding domains are typically single chain variable fragments (scFvs) derived from an antibody engineered against the tumor antigen. However, despite tremendous success of this therapy the field currently faces some challenges, mainly the exhaustion of CAR T cells which leads to poor persistence and therapy failure. One reason for this phenomenon is the constant activation of T cells which is known as tonic signaling. However, despite the importance of this topic it is poorly understood how tonic signaling is initiated. There is no assay available to screen scFvs at an early timepoint of development to assess which proteins are suitable and safe for the use in CAR T cells.- In this project, we propose to assess which biochemical features determine the likelihood of an scFv to induce tonic signaling. With this, we aim to identify high throughout assays that can be used for screening purposes in the future.

T-Zelltherapien, speziell T-Zellen die mit einem chimären antigen Rezeptor (CAR) ausgestattet sind, haben in den vergangenen Jahren wesentlich zum Erfolg der zellulären Therapien für die Behandlung von Leukämien beigetragen. Obwohl seit mehr als 30 Jahren in diesem Bereich geforscht wird, ist das Verständnis wie die einzelnen Komponenten zur Signalübertragung in der T-Zelle beitragen snoch immer limitiert. In diesem Projekt wird sie Signalübertragung in CAR T-Zellen nach Bindung an ein Tumorantigen untersucht. Dazu werden verschiedene Komponenten, die zur Signalkaskade beitragen verändert und die Effekte auf die Funktion der CAR T-Zelle untersucht.